什么是液相色譜?

歷史概述和定義

液相色譜的定義是二十世紀(jì)早期由俄羅斯植物學(xué)家 Mikhail S. 茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來(lái)分離從植物中提取的化合物[樹(shù)葉色素]。茨維特用顆粒填滿開(kāi)口的玻璃柱。他發(fā)現(xiàn)兩種特殊的材料，粉筆末(碳酸鈣)和氧化鋁很有用。他將樣品[混勻植物葉的溶劑提取物]倒入柱中，并讓樣品流過(guò)顆、粒床。隨后加入純?nèi)軇ｋS著樣品由于重力自上而下流過(guò)柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開(kāi)，因?yàn)橛行┙M分比另外一些移動(dòng)得快。他將這些分開(kāi)的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關(guān)聯(lián)。他還根據(jù)每一種化合物對(duì)填料的化學(xué)親和性強(qiáng)弱，提出了分析這些化合物的分離規(guī)律。與顆粒填料有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)慢，與溶劑有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)快。這個(gè)過(guò)程可這樣描述:樣品中的化合物在流動(dòng)的溶劑(流動(dòng)相)與固體顆粒(固定相)間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動(dòng)，從而產(chǎn)生了化合物之間的分離。

茨維特使用色譜法 chromatography [來(lái)自希臘字， chroma 意思是顏色， graphy 意思是記錄 - 直譯為顏色記錄](méi) 來(lái)描述他的彩色試驗(yàn)。[令人好奇的是, 俄羅斯名字茨維特意思是顏色。]今天，液相色譜法,以各種形式，已成為分析化學(xué)中十分有力的工具之一。

技術(shù)1. 樣品被點(diǎn)在固定在玻璃板上的薄層色譜顆粒[固定相]上，并流過(guò)薄層[圖 B]。玻璃板的底端放置在溶劑中。由毛細(xì)作用產(chǎn)生的流動(dòng)使溶劑[流動(dòng)相]擴(kuò)散到干燥的顆粒層并沿玻璃板向上移動(dòng)。這種技術(shù)被稱為薄層色譜法或 TLC。

技術(shù) 2. 在圖 C 中, 樣品被點(diǎn)在紙上[固定相]。溶劑[流動(dòng)相] 加在樣品點(diǎn)的中心以產(chǎn)生向周圍的輻射流動(dòng)。這是紙層析的一種方式。[傳統(tǒng)的紙層析色譜和直線流動(dòng)的薄層色譜是類似的操作方式。]上圖中，相同的黑色 FD 和 C 染料被點(diǎn)在紙上。

圖 C: 紙層析法

當(dāng)和薄層色譜板比較的時(shí)候，請(qǐng)注意這種特殊紙張分離能力的區(qū)別。綠色圓環(huán)表示這張紙無(wú)法分離黃色和藍(lán)色染料，但它可以將紅色染料分離開(kāi)來(lái)。下圖中，由同樣的黃色和藍(lán)色染料組成的一個(gè)綠色樣品點(diǎn)在紙上。如你能預(yù)料的，這張紙無(wú)法分離這兩個(gè)染料。在圖中，由紅色和藍(lán)色組成的紫色樣品被點(diǎn)在紙上，它們被分離得
很好。

技術(shù)3.在這個(gè)十分有效的方法中，樣品流進(jìn)一個(gè)柱子或填有適當(dāng)顆粒[固定相]的柱管裝置。這些顆粒稱為色譜填料。溶劑[流動(dòng)相]流過(guò)這個(gè)裝置。在固相萃取中[SPE]，樣品被裝入柱管里，溶劑攜帶樣品流出這個(gè)裝置。正如在茨維特的試驗(yàn)中，樣品中化合物由于在管路中的流動(dòng)速度不同而得以分開(kāi)。黑色樣品被放入柱管里。每一步使用不同溶劑得到分離。

 

圖 D-1: 柱色譜法 - 固相萃取 [SPE]

當(dāng)使用管路的形式時(shí)，有幾種方法可以產(chǎn)生流動(dòng)。重力或真空可用在不能承受壓力的柱子上。特別是，本試驗(yàn)中使用的顆粒粒徑較大[大于五十微米]，所以產(chǎn)生的流動(dòng)阻力很小。開(kāi)口玻璃柱[茨維特的實(shí)驗(yàn)]是個(gè)典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是針筒的形狀，可裝入填充物顆粒用于分離樣品。這種方法稱為固相萃取[SPE]。在此，管狀的色譜裝置稱為固相萃取小柱，通常在真空助力下流動(dòng)，被用來(lái)凈化復(fù)雜樣品以便進(jìn)一步分析。要想提高分離能力，必須使用粒徑小的填料顆粒[小于十微米]。然而，小顆粒對(duì)流動(dòng)產(chǎn)生更大的阻力，所以要獲得預(yù)期的溶劑流速，需要更高壓力。必須設(shè)計(jì)能承受更高壓力的泵和柱子。利用中高壓力使溶劑流過(guò)色譜柱的方法，就稱為 HPLC。

圖 D-2: HPLC柱

什么是高效液相色譜法[HPLC]?

縮寫 HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會(huì)上的文章，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓 (high-pressure) 這個(gè)事實(shí)。早期的泵只能承受 500 psi [35bar]。這就被稱為高壓液相色譜法[HPLC]七十年代早期取得極大進(jìn)步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6,000 psi [400 bar]的壓力，還能配上改進(jìn)的進(jìn)樣器，檢測(cè)器和色譜柱。高壓液相色譜法確實(shí)開(kāi)始成為二十世紀(jì)七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)[更小顆粒，更高壓力], 字母縮寫保持一樣，但全稱變?yōu)楦咝?(high-performance) 液相色譜[HPLC]。高效液相色譜[HPLC]是目前分析化學(xué)十分強(qiáng)大的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬(wàn)分之一[ppt]也可。